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Chagas: estandarizan técnica para tipificar los parásitos de la enfermedad

Cerca de 8 millones de personas en todo el mundo están infectadas con el Trypanosoma cruzi, el parásito que causa la enfermedad de Chagas. En la Argentina, hay regiones que presentan una altísima prevalencia de la enfermedad sobre todo en poblaciones aborígenes.

En la carrera por conocer más sobre esta patología, los investigadores vienen trabajando desde hace varios años para dar con un test molecular ideal que les permita conocer la cantidad de parásitos y su genotipificación en tiempo real que circulan en la sangre de un enfermo para poder ajustar la terapia correspondiente.

En un trabajo publicado recientemente se da a conocer el desarrollo de un ensayo denominado “Multiplex PCR en Tiempo Real con sondas TaqMan”, que permitió tipificar un set de muestras provenientes de diferentes países.

A los efectos de ajustar esta técnica investigadores del Instituto de Medicina Regional de la UNNE, bajo la coordinación del Instituto de Investigaciones en Ingeniería Genética y Biología Molecular (INGEBI-CONICET) realizaron una puesta a punto para su aplicación.

A este trabajo se lo denomina “estandarización de la técnica”. Esto es, poner perfectamente bien delimitado cuáles son los reactivos que se van a utilizar, tipos de muestras de extracción de ADN con los que se trabajará, en qué pacientes y cuál será la interpretación de esa técnica.

La denominación “Multiplex PCR” se debe a que utiliza varios reactivos al mismo tiempo para detectar los tipos de Unidades Discretas de Tipificación (UDTs) del protozoo T. cruzi. Este parásito puede ser clasificado en 6 UDTs, basado en 3 regiones genómicas nucleares. Estas UDTs están diferencialmente distribuídas en la áreas endémicas y su nomenclatura permitió, entre otras aplicaciones, el descubrimiento de nuevas drogas parasiticidas y el monitoreo de la enfermedad.

Las sondas TaqMan se utilizan como método de detección del ADN amplificado en Tiempo Real ya que la “sonda” (secuencia específica de ADN complementaria a una región del genoma del parásito) se une al producto de PCR (material genético amplificado) y una enzima la digiere, liberando un colorante fluorescente que permite ver el producto amplificado al mismo tiempo que se genera (en tiempo real).

Técnica y ventaja. El proceso comienza extrayendo una muestra de sangre del paciente, aislando su ADN y amplificándolo en un equipo denominado “termociclador”. Con esto se logra justamente amplificar el material genético del T. cruzi

¿Qué pasos se dan para llegar a conocer las UDTs?. Al contar con un ADN “molde” purificado se puede utilizar para que todos los reactivos al mismo tiempo hagan su trabajo por hibridación y posteriormente amplificarlo. Se trata en realidad de que en una sola reacción de PCR se logre identificar distintas UDts a través del uso de variados iniciadores y sondas.

La PCR es una  técnica in vitro que luego de la amplificación hace mucho más fácil identificar virus, hongos, o bacterias causantes de una enfermedad con una alta sensibilidad y especificidad.

UDTs. Conocer estas unidades es un importante dato epidemiológico, ya que permite saber el linaje del T. cruzi que circula en una región. En ese sentido se sabe que en las provincias con Chagas en la Argentina están presentes los linajes II, V y VI. Estos números son clasificaciones particulares que los vinculan con los ancestros de esos parásitos, pero que a los científicos les sirve para conocer cómo se mueve la patología a través de diferentes localidades endémicas.

La ventaja que presenta el ensayo es que con una sola reacción se obtiene mucha información optimizando reactivos y muestra, ya que no siempre se cuenta con mucho ADN de los pacientes.

¿Qué ocurría antes de desarrollar esta técnica? Usando métodos convencionales de PCR para tipificación se consumía mucho tiempo y dependía de la realización de un cultivo previo de los parásitos que podían subestimar la complejidad de la infección natural, debido a la coexistencia de poblaciones policlonales que pertenecían a diferentes UDTs. En consecuencia  al pasar por  el cultivo in vitro se favorecía la detección de los clones de parásitos más competitivos.

Resultados. De acuerdo a lo expresado por el doctor Horacio Lucero, investigador del Area de Biología Molecular del Instituto de Medicina Regional que recibió capacitación en el INGEBI para la aplicación de esta y otras técnicas ya transferidas , “el nuevo protocolo de Tipificación publicado funcionó muy bien con muestras de pacientes con Chagas agudo, de insectos vectores y mamíferos reservorios. En muestras de pacientes con Chagas crónico, donde la carga parasitaria es mucho menor,  fue menos satisfactorio”.

Por otra parte, agregó Lucero, “permitió detectar algunas infecciones mixtas, pero la incidencia de las mismas hasta ahora era desconocida debido a que los métodos de tipificación previos sólo determinaban un solo UDT dominante”.

En el trabajo publicado se detalla que se logró la tipificación de 307 muestras biológicas diferentes y 39 cepas cultivadas de parásitos. Las muestras provenían de pacientes con Chagas, reservorios animales, e insectos vectores de una docena de los 21 países endémicos de América como también de laboratorios Europeos.

Por último el doctor Lucero señaló que el paso siguiente es el diseño de kits de tipificación en base a esta nueva metodología.

Juan Monzón Gramajo

18 de junio de 2015